Gram-värjäys on nopea tekniikka, ja sitä käytetään näkemään bakteerien läsnäolo kudosnäytteessä ja luokittelemaan bakteerit gram-positiivisiksi tai gram-negatiivisiksi niiden soluseinien kemiallisten ja fysikaalisten ominaisuuksien perusteella. Gram -värjäystä käytetään lähes aina ensimmäisenä vaiheena bakteeri -infektion diagnosoinnissa.
Tämä värjäystekniikka on nimetty tanskalaisen tiedemiehen Hans Christian Gramin (1853 - 1938) mukaan, joka kehitti tekniikan vuonna 1882 ja julkaisi sen vuonna 1884 tekniikkana erottaa toisistaan kaksi bakteerityyppiä, joilla on samanlaisia kliinisiä oireita: Streptococcus pneumoniae (tunnetaan myös nimellä Streptococcus pneumoniae). Pneumokokit) ja bakteerit Klebsiella pneumoniae.
Vaihe
Menetelmä 1: 3: Mikroskooppilevyn valmistelu
Vaihe 1. Valmistaudu työskentelemään laboratoriossa
Käytä käsineitä ja pitkää hiusnauhaa, jotta estät testattavan näytteen bakteerikontaminaation. Puhdista työtila liesituulettimen alla tai muussa hyvin ilmastoidussa tilassa. Tarkista Bunsen -poltin ja varmista, että mikroskooppi toimii oikein ennen kuin aloitat.
Vaihe 2. Steriloi mikroskoopin lasilevy
Jos lasilevy on likainen, pese se saippuavedellä öljyn ja lian poistamiseksi. Puhdista lasit etanolilla, lasinpuhdistusaineella tai muulla laboratorion käyttämällä menetelmällä.
Vaihe 3. Aseta näyte lasille
Gram -värjäystekniikan avulla voit tunnistaa bakteerit lääketieteellisessä näytteessä tai bakteeriviljelmän, joka kasvaa Petri -maljassa. Parhaat tulokset saat käyttämällä Gram -tahraa näytteen ohuilla vedoilla. On suositeltavaa käyttää näytteitä, jotka ovat alle 24 tuntia vanhoja, koska vanhemmat bakteerit ovat saattaneet vahingoittaa soluseiniään eivätkä välttämättä reagoi gram -värjäykseen.
- Jos käytät kudosnäytettä, lisää 1-2 tippaa lasilevyyn. Levitä tasaisesti objektilasille ja muodosta ohut kerros näytteitä, liu'uttamalla sitä toisen steriilin lasilevyn reunan avulla. Anna sen kuivua ennen seuraavan vaiheen tekemistä.
- Jos otat bakteereita Petri -maljasta, steriloi inokulaatiosilmukka Bunsen -polttimessa, kunnes se hehkuu, ja anna sen jäähtyä. Tiputa silmukalla steriiliä vettä objektilasille, steriloi ja jäähdytä sitten uudelleen ennen kuin käytät sitä pienen bakteerinäytteen keräämiseksi. Sen jälkeen sekoita varovasti.
- Liemessä valmistetut bakteerit on sekoitettava uudelleen pyörrelaitteella ja otettava sitten ymppäyssilmukalla kuten edellä, lisäämättä vettä.
- Jos sinulla on vanupuikkonäyte (yleensä pienellä puuvillakärkisellä kahvalla), kosketa ja kierrä vanupuikkoa varovasti luistin päällä.
Vaihe 4. Hieman korkea lämpötila voi tehdä hyvän tahran
Lämpö pitää bakteerit luistin päällä, joten ne eivät liukene helposti värjäysprosessin aikana. Napauta liukumäkeä nopeasti kaksi tai kolme kertaa Bunsen -polttimen päällä tai lämmitä luistia sähköisen lämmittimen päällä. Älä ylikuumenna, näyte voi vaurioitua. Jos käytät Bunsen -poltinta, sen pitäisi olla pieni mutta sininen liekki suuren oranssin liekin sijasta.
Vaihtoehtoisesti voite voidaan tehdä myös metanolilla lisäämällä 1-2 tippaa metanolia kuivaan määritykseen ja kuivaamalla metalleen jäänyt metanoli jättämällä se ulkoilmaan. Tämä tekniikka minimoi soluvaurioita ja tarjoaa puhtaan diakuvan taustan
Vaihe 5. Aseta luisti väritysalustan päälle
Värjäysastiat on valmistettu metallista, lasista tai matalasta muovilevystä, ja niiden päällä on pehmeä verkko. Aseta diat näiden verkkojen päälle, jotta käyttämäsi neste voidaan valuttaa lokeroon.
Jos sinulla ei ole väritysalustaa, voit asettaa dian muovialustalle jääpalojen tulostamiseksi
Menetelmä 2/3: Gram -tahraprosessi
Vaihe 1. Kaada kristallivioletti neste tahran päälle
Suihkuta pipetillä näytettä bakteereista muutamalla tipalla kristalliviolettiväriainetta, joka tunnetaan myös nimellä gentianvioletti. Anna vaikuttaa 30-60 sekuntia. Kristallivioletti (KV) erottuu vesiliuoksessa KV+ ja kloridi (Cl-) -ioneiksi. Nämä ionit tunkeutuvat sekä grampositiivisten että gramnegatiivisten bakteerien soluseiniin ja solukalvoihin. KV+ -ioni on vuorovaikutuksessa bakteerisolujen negatiivisesti varautuneiden komponenttien kanssa, jolloin solut saavat violetin värin.
Monet laboratoriot käyttävät "Hucker" -kideviolettia, joka sisältää ammoniumoksalaattia saostumisen estämiseksi
Vaihe 2. Huuhtele kristallivioletti varovasti
Kallista luistia ja suihkuta pesupullolla pieni tislatun tai vesijohtoveden liukumäen päälle. Veden tulisi valua tahran pinnan yli, eikä sitä saa suihkuttaa suoraan tahraan. Älä huuhtele liikaa. Se voi poistaa värjäytymisen grampositiivisista bakteereista.
Vaihe 3. Huuhtele tahra jodilla ja huuhtele
Huuhtele tahra jodilla tiputin avulla. Anna vaikuttaa vähintään 60 sekuntia ja huuhtele sitten varovasti samalla tavalla kuin yllä. Jodi negatiivisesti varautuneen ionin muodossa vuorovaikutuksessa KV+: n kanssa muodostaa suuren yhdistekompleksin kristallivioletin ja jodin välille (CV-I-yhdistekompleksi) solun sisä- ja ulkokerroksissa. Tämä yhdisteiden kompleksi säilyttää kristallivioletin violetin värin solun sisällä, värjätyissä kohdissa.
Jodi on syövyttävä aine. Vältä hengittämistä, nielemistä tai ihokosketusta
Vaihe 4. Lisää värivalkaisuainetta ja huuhtele pois nopeasti
Tähän tärkeään vaiheeseen käytetään yleensä 1: 1 asetonin ja etanolin seosta, joka on ajoitettava huolellisesti. Aseta luisti tiettyyn kulmaan ja lisää värinvalkaisuainetta, kunnes huuhteluvedessä ei enää näy purppuraa. Tämä kestää yleensä alle 10 sekuntia tai jopa vähemmän aikaa, jos valkaisuaine sisältää korkean pitoisuuden asetonia. Lopeta tämä vaihe heti, muuten väri liuottaa myös kristalliviolettia grampositiivisista ja negatiivisista soluista, ja värjäysprosessi on toistettava. Huuhtele ylimääräinen värinvalkaisuaine välittömästi pois edellisellä tekniikalla.
- Puhdasta asetonia (95%+) voidaan käyttää korvikkeena. Mitä enemmän asetonia käytät, sitä nopeammin valkaisuaine toimii, joten sinun on kiinnitettävä enemmän huomiota ajoitukseen.
- Jos sinulla on vaikeuksia seurata tämän vaiheen aikaa, lisää väriä valkaisuainetta tipoittain.
Vaihe 5. Ripottele vastaväriä tahran päälle ja huuhtele
Vastavärjäystä, tavallisesti safraniinia tai fuksiinia, käytetään lisäämään kontrastia gramnegatiivisten ja grampositiivisten bakteerien välillä värjäämällä värittömiä (värjäytymättömiä) bakteereja, eli gramnegatiivisia bakteereja, vaaleanpunaisia tai punaisia. Anna vaikuttaa vähintään 45 sekuntia, huuhtele sitten.
Fuchsin värjää voimakkaasti monia gram-negatiivisia bakteereja, kuten Haemophilus spp ja Legionella spp. Tämä menetelmä on hyvä aloittelijoille
Vaihe 6. Kuivaa luisti
Voit kuivata ne ulkona tai kuivata käyttämällä tätä tarkoitusta varten myytyä raamatullista paperia.
Tapa 3/3: Väritystulosten tarkistaminen
Vaihe 1. Valmistele valomikroskooppi
Aseta luisti mikroskoopin alle. Bakteerien koko vaihtelee suuresti, joten tarvittava suurennus vaihtelee 400x - 1000x. Tarkempaan kuvaan suositellaan objektiivilinssiä, jossa on upotusöljyä. Pudota upotusöljy objektilasille välttäen liikettä tiputuksen aikana, jotta kuplia ei muodostu. Siirrä mikroskoopin linssin kahvaa niin, että objektiivi napsahtaa paikalleen ja koskettaa öljyä.
Öljy -upotusta voidaan käyttää vain erityislinsseissä, ei "kuivissa"
Vaihe 2. Yritä tunnistaa grampositiiviset ja gramnegatiiviset bakteerit
Tutki objektilasia valomikroskoopilla. Gram-positiiviset bakteerit näyttävät violetilta, koska kristallivioletti on loukussa paksun soluseinän sisällä. Gramnegatiiviset bakteerit ovat väriltään vaaleanpunaisia tai punaisia, koska kristallivioletti huuhdellaan pois ohuiden soluseinien läpi, joihin vaaleanpunainen vastaväri tulee.
- Jos näyte on liian paksu, tulos voi olla väärä positiivinen. Ota uusi näyte, jos siinä näkyy kaikki grampositiiviset bakteerit, varmistaaksesi, että tulos on oikea.
- Jos käytät liikaa värivalkaisua, tulos voi olla väärä negatiivinen. Ota uusi näyte, jos siinä näkyy kaikki gramnegatiiviset bakteerit, varmistaaksesi, että tulos on oikea.
Vaihe 3. Vertaa näkemiäsi tuloksia vertailukuvaan
Jos et tiedä, miltä bakteerit näyttävät, tutustu viitekuvakokoelmaan, joka on yleensä lajiteltu muodon ja gramma -tahran mukaan. Voit myös tarkastella online -tietokantoja osoitteessa [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos ja monet muut online -sivustot. Tunnistamisen helpottamiseksi alla on esimerkkejä bakteereista, joita tavataan yleisesti tai jotka ovat tärkeitä diagnoosin kannalta ja jotka on luokiteltu niiden grammatilan ja muodon mukaan.
Vaihe 4. Tunnista grampositiiviset bakteerit niiden muodon perusteella
Bakteerit luokitellaan edelleen niiden muodon mukaan mikroskoopilla, yleisimmin kokkeina (pallomaisina) tai tankoina (lieriömäisinä). Seuraavassa on muutamia esimerkkejä grampositiivisista bakteereista (violetti väri) niiden muodon mukaan:
- Gram -positiiviset kokit yleensä stafylokokit (eli ryhmäkookit) tai streptokokit (ketjukokit).
- 'Gram -positiiviset sauvat, kuten Bacillus, Clostridium, Corynebacterium ja Listeria. Sauvabakteerit Actinomyces spp. on yleensä oksia tai filamentteja.
Vaihe 5. Tunnista gramnegatiiviset bakteerit
Gram-negatiiviset bakteerit (väriltään vaaleanpunainen) luokitellaan usein kolmeen ryhmään. Kokit ovat muodoltaan pallomaisia, tangot ovat pitkiä ja ohuita, kun taas kookotangot ovat niiden välissä.
- Gramnegatiiviset kokit Yleisin on Neisseria spp.
- Gram-negatiiviset sauvat esim. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas ja monet muut. Vibrio cholerae voidaan nähdä tavallisena tai taivutettuna.
- Gramnegatiiviset "kokkoidi" (tai "coccobacilli") sauvabakteerit esim. Bordetella, Brucella, Haemophilus ja Pasteurella
Vaihe 6. Tarkista huolellisesti, ovatko tulokset sekavia
Joitakin bakteereja on vaikea värittää tarkasti niiden soluseinien haurauden tai vahamaisuuden vuoksi. Nämä bakteerit voivat näyttää violetin tai vaaleanpunaisen seoksen samassa solussa tai saman solun eri solujen välillä. Yli 24 tuntia vanhemmat bakteerinäytteet voivat osoittaa tämän ongelman, mutta on myös joitain bakteerilajeja, joiden värjääminen on vaikeaa missä tahansa näytteenottoikässä. Nämä bakteerit vaativat erikoistuneempia testejä tunnistamiseen, kuten happokestävä värjäys, havaitseminen bakteeriviljelmässä, TSI-viljelyalusta tai geneettinen testaus.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium ja Propionibacterium spp. kaikki ovat grampositiivisia bakteereja, mutta eivät useinkaan ole selvästi värjätyt.
- Pienet, ohuet bakteerit, kuten Treponema, Chlamydia ja Rickettsia spp. vaikea värjätä Gram -menetelmällä.
Vaihe 7. Hävitä jäljellä olevat kulutustarvikkeet ja laitteet
Tämä jätteenkäsittelymenettely vaihtelee laboratorioiden välillä ja riippuu käytetyistä materiaaleista. Yleensä värjäysastian neste hävitetään pulloissa, jotka on merkitty vaaralliseksi jätteeksi. Liota lasit 10% valkaisuliuoksessa ja hävitä sitten terävien esineiden astiaan.
Vinkkejä
- Muista, että Gram -värjäystulokset ovat hyviä vain, jos näyte on hyvä. On tärkeää informoida potilaita, jotta he voivat toimittaa hyvän näytteen (esim. Ero sylkemisen ja syvän yskän välillä ysköksenäytteen saamiseksi).
- Värivalkaisimena etanoli reagoi hitaammin kuin asetoni.
- Noudata laboratoriomääräyksiä turvallisuuden varmistamiseksi.
- Käytä poskipyyhettä harjoitteluun, koska se sisältää sekä grampositiivisia että gramnegatiivisia bakteereja. Jos näet vain yhden bakteerityypin, saatat käyttää liian vähän tai liikaa valkaisuainetta.
- Voit kiinnittää luistin puisilla lukkoilla.
Varoitus
- Asetoni ja etanoli ovat helposti syttyviä aineita. Asetoni poistaa öljyn käsistäsi, mikä helpottaa ihon imeytymistä muihin kemikaaleihin. Käytä käsineitä ja käytä niitä varoen.
- Älä anna tahran kuivua ennen kuin huuhtelet pois Gram -tahran tai vastapinnan.
Mitä tarvitset
- Verkkoesimerkki
- Lasinen liukumäki
- Pipetti
- Pieni palolähde tai liukulämmitin tai metanoli
- Vesi
- Kristallivioletti
- Jodi
- Värivalkaisuaine, kuten alkoholi tai asetoni
- Safranin
